ELISA試驗之雙抗體夾心法與間接法過程

 ELISA試驗之雙抗體夾心法與間接法過程：

一、雙抗體夾心法：
1、包被：用0.05M
PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3、加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6、結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
二、間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。